Zu Beginn wählten wir zwei Aminosäuresequenzen aus der CASP6-Liste aus.

Wir entschieden uns für:

Tar-Id	Proteinbezeichnung	Beschreibung
T0257	AAG03475	Conserved hypothetical protein, P. aeruginosa PAO1
T0276	1wkc	Conserved hypothetical protein, T. thermophilus

Die spätere Vorhersage einer Tertiärstruktur, für die ausgesuchten Proteinen, beruht auf der Annahme, dass ähnliche Primärstrukturen auch ähnliche Tertiärstrukturen ausbilden. Aus diesem Grund galt es nun, zu den ausgesuchten Proteinen, Proteine mit einer möglichst ähnlichen Aminosäuresequenz zu finden. Bei der Ermittlung homologer Proteine hatten wir mehrere Möglichkeiten, hielten uns aber an eine feste Abarbeitungsreihenfolge: Eine genau Beschreibung der allgemeinen Vorgehensweise ist hier zu finden.

Folgende Schritte unternahmen wir, um Proteinhomologien zu erkennen:

• Suche nach konservierten Domänen mittels rpsblast.
• Auswerten der Treffer einer normalen Protein-Protein Suche mittels blastp. Eine signifikante Häufung bestimmter Organismengruppen lässt unter Umständen Rückschlüsse auf Homologien zu.
• Praktischerweise ermittelte auch FUGUE Proteinhomologien direkt.
• Wir versuchten unser Glück mit Superfamily.
• Eine letzte Möglichkeit ergab sich durch ProtoNet.

Zielprotein	pdb-Code | homologes Protein | Proteinklasse	gefunden durch
T0257	1ugi | Uracil-DNA Glycosylase Inhibitor Protein | Glycosylase Inhibitor	Superfamily
T0276	1sou | 5,10-Methenyltetrahydrofolate Synthetase | Ligase	FUGUE

Von den in Step 1 ermittelten homologen Proteinen galt es nun die Tertiärstruktur zu finden. Dies sollte sich als ungewohnt schwierig erweisen, denn es standen nicht immer unmittelbare Download-Links zur Verfügung. Oft mussten wir uns durch grosse Linkfarmen hangeln, um letzlich doch mit leeren Händen da zu stehen. Die verwendeten Datenbanken lassen sich in der Link-Sektion dieses Protokolls finden. Die Tertiärstrukturinformationen sind in pdb-Dateien (Protein-Data-Base-Dateien) gespeichert.

homologes Protein pdb-Datei 1ugi : erstes Modell 1ugi_1.pdb 1ugi : alle Modelle 1ugi.pdb 1sou : erstes Modell 1sou_1.pdb 1sou : alle Modelle 1sou.pdb

Anmerkung: Wir verwendeten zwei verschiedenen Versionen von pdb-Dateien. Die pdb-Dateien der Einzelmodell reprästentieren sind allerdings nur Auszüge aus den 20er-Modellsammlungen.

Für die Tertiärstrukturvorhersage der gewählten Proteine ist ein Alignment zwischen Target-Sequenz und homologem Protein nötig Das Sequenzalignment wurde mit dem Web-Interface FUGUE durchgeführt. Wir verwendeten ein Alignment im pir-Format.

Zielprotein	homologes Protein	Alignment
T0257	1ugi	T0257 - 1ugi_1
T0276	1sou	T0276 - 1sou_1

In diesem Schritt erfolgt die eigendliche Berechnung der Tertiärstruktur des Zielproteins. Hierzu wurde das Programm Modeller benutzt. Dieses Programm berechnete uns eine mögliche Tertiärstruktur aus der Strukturinformation von homolgem Protein und dem Alignment von Target und Homologem.

Protein	Model Nr.	erzeugtes pdb für das Zielprotein
1ugi	alle	keins, siehe Ergebnisse
1sou	1	pdb-Datei
1sou	2	pdb-Datei
1sou	3	pdb-Datei
1sou	4	pdb-Datei
1sou	5	pdb-Datei
1sou	6	pdb-Datei
1sou	7	pdb-Datei
1sou	8	pdb-Datei
1sou	9	pdb-Datei
1sou	10	pdb-Datei
1sou	11	pdb-Datei
1sou	12	pdb-Datei
1sou	13	pdb-Datei
1sou	14	pdb-Datei
1sou	15	pdb-Datei
1sou	16	pdb-Datei
1sou	17	pdb-Datei
1sou	18	pdb-Datei
1sou	19	pdb-Datei
1sou	20	pdb-Datei

Die in Step 4 erzeugten Tertiärstruktur-Vorhersagen lassen sich nun grafisch veranschaulichen. Diese grafische Darstellung der räumlichen Struktur des Moleküls erfolgte mit dem 3D-Modelierungsprogramm VMD (Visual Molecular Dynamics). Das Programm visualisiert Moleküle an Hand der Strukturinformationen der zugehörigen pdb-Datei.

Die einzeknen Ergebnisbilder dieses Programmes findet man im Ergebnisbereich dieses Protokolls.

Ein weiterer wichtiger Schritt war es nun, die in Step 4 erzeugte Tertiärstruktur auf ihre Gültigkeit zu überprüfen.
Hierzu hinterfragten wir die Wahrscheinlichkeit der vorhergesagten Struktur, die sich im sogenannten RMS-Wert wiederspiegelte. Dieser gibt den mittleren Abstand zwischen zwei Molekülen an. Unter Abstand ist die unterschiedliche Lage der einzelnen Abschnitte des Moleküls im Raum zu verstehen. Die Einheit, in der dieser Wert angegeben wird, ist Anström.
Um den RMS-Wert zu berechnen wurde das Programm ProFit verwendet. ProFit benötigt zwei pdb-Datein für die beiden zu vergleichenden Tertiärstrukturen und das passende Sequenzalignment der Ausgangsproteine. Im Programm mussten eine Reihe von Befehlen eingegeben werden. Sinnvollerweise lagerten wir diese in folgendes Skript aus:

• REFERENCE <homologes Protein>.pdb
• MOBILE <Zielprotein>.pdb
• READALIGNMENT <Alignment>.ali
• IGNOREMISSING
• FIT
• RMS
• WRITE <neuer Bezeichner>.pdb

ProFit berechnete uns RMS-Werte und zugleich eine neue pdb-Datei für das Zielprotein. Die räumliche Lage des Targets wurde durch das Programm an die des homologen Proteins angepasst, so dass ein Vergleich leichter möglich ist.

Der zweite Schritt, der die erzeugte Tertiärstruktur testet, ist das Erzeugen einer Energiekurve des Moleküls. Diese Kurve wurde mit dem Programm Prosa erzeugt. Prosa erwartete folgende Eingaben:

• read pdb <homologes Protein>.<homologes Protein>
• read pdb <Zielprotein>.pdb <Zielprotein>
• analyse energy *
• color * <homologes Protein> <Farbe>
• color * <Zielprotein> <Farbe>
• color back <Farbe>
• color axis <Farbe>
• color title <Farbe>
• winsize *25
• pscolor = 1
• plot
• export plot Name

Wir erhielten zwei Energiekurven im post-script Format, einzusehen in der Ergebnissektion dieses Protokolls.

Der letzte Schritt des Praktikums war die Erstellung einer geeigneten Dokumentation über alle abgelaufenen Vorgänge. Damit das Protokoll einfach zugänglich ist, und von so vielen Personen wie möglich ohne zusätzlichen Software-Aufwand zu betrachten ist, verfassten wir diese Webseiten. Das Ergebnis sehen sie nun vor sich.