Dazu wird das Programm RNAalifold benutzt. Als Eingabe dient ein clustalw Alignment. Eine Repräsentation der Sekundärstruktur über alle in dem Alignment vorkommenen Sequenzen in dem .,),( Format wird erstellt. Beispiel für miRNA-10:
44 sequences; length of alignment 143.
__________C___AAGGU_UUACUGUCGUCUAUAUAUACCCUGUAGAUCCGAAUUUG...
...........................((.(((((......((..((((.((((((((((.
minimum free energy = -16.12 kcal/mol (-14.70 + -1.42)
Erzeugt wird eine Darstellung der Sekundärstruktur in graphischer Form mit der Paarung der einzelnen Basen und den charakteristischen Hairpin-loops und Stems. Ein Link zu allen Strukturen befindet sich in Abschnitt 3.2.