Ausgehend aus den Alignments wird für jede miRNA ein NJ Baum erstellt. Die einzelnen clustalw Alignment Dateien (miRNA-*.aln) können direkt in die Applikation SplitsTree reingeladen werden oder es kann zunächst aus dem clustalw Alignment ein Nexus Format erstellt werden. Im letzteren Fall wird das .aln Format mit Nexus Header und Footer versehen und die Alignment Blöcke in eine Form gebracht, die SplitsTree verarbeiten kann. SplitsTree zeichnet einen Phylogenetischen Baum (siehe Abschnitt 3.3). Im Menü Trees wird ausgewählt einen Neighbour Joining (NJ) Baum zu generieren.