Funktionen TNF Aktivierung des NFkB-Signlaweges: TNF (233 As) bindet extrazellulaer an den TNF-Rezeptor. Dadurch werden an der intrazellulaeren Domäne Adapterproteine rekrutiert, die letzendlich Proteinkinasen aktivieren. Intrazellulaer wird der Transkriptionsfaktor NFkB kontinuierlich exprimiert, durch Dimerisierung mit der k-Kette des Immunglobulin B wird NFkB jedoch inaktiviert. Die aktivierten Proteinkinasen phosphorylieren IkB, wodurch NFkB freigesetzt wird. Dadurch kann der Transkriptionsfaktor in den Nucleus diffundieren, wo er für die Transkription von mind. 150 verschiedenen Genen verantwortlich ist. -> Einleitung von inflammatorischen Prozessen Initiation der Apoptose: Durch die Bindung von TNF an den TNF-Rezeptor koennen auch Caspasen (8 und 10) aktiviert werden. Durch weitere Signalkaskaden wird die Caspase 3 aktiviert, das sogenannte Apoptosom. Dadurch wird der kontrollierte Zelltod initiiert. PKR Inhibition der Translation: PKR wird in den meisten Zellen kontinuierlich exprimiert. Durch Bindung doppelstraengiger RNA (z.B. dsRNA-Viren, zellulaere mRNA) erfolgt die Regulation. In erster Linie ist dabei die Struktur verantwortlich. Aktivierte PKR phosphoryliert u.a. die alpha-Untereinheit des Initiationsfaktor eIF2. Dadurch kann der Initiationskomplex mit der 40 S UE der Ribosomen nicht gebildet werden. -> Inhibition der Translation Vorueberlegungen Ergebnisse von Osman et al 1999 Die Arbeitsgruppe um Osman hat die 3'UTR mit verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten. Anschliessend wurde das Potential zur Aktivierung der PKR bestimmt. Dabei stellte sich heraus, dass ein ca. 100 nt langes Fragment die hoechste Aktivitaet initiieren konnte. Dieses Segment liegt ca. 200 nt downstream von Exon 4. Aktivatorsequenz und Struktur
Links dargestellt sind die Fragmente, welche durch den Einsatz verschiedener Restriktionsenzyme erhalten wurden, in der unteren Abbildung ist deren Potential zur
Aktivierung der PKR gezeigt. Auf der rechten Seite ist eine Sekundaerstruktur dargestellt, welche sich in dem "EP"-Segment befindet.
Offensichtlich ist der Stemloop fuer die Aktivierung von PKR von besonderer Bedeutung, da hier die eine doppelstraengige RNA gebildet wird.
Struktur des TNFa-Gens
Dargestellt ist der TNF-Genlokus von Homo Sapiens. Das Protein wird aus 4 Exons zusammengesetzt.
Zielstellung des Praktikums
Zu Beginn wurde die phylogenetische Verbreitung von TNFa untersucht. Durch diese Information sollte der vermutete Aktivator bezueglich der Sequenz- und
Strukturkonservierung untersucht werden.
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