Einleitung

Was ist eine miRNA?

MicroRNAs (miRNA) wurden ursprünglich in Caenorhabditis elegans entreckt, koennen aber in den meisten Eukaryoten (inkl. dem Menschen) gefunden werden. miRNAs haben schäetzungsweise einen von 1-5% am menschlichen Genom und regulieren ca. 30% aller protein-codierenden Gene [1].
MiRNAs sind kleine (21-25 nt)[2], evolutionär hoch konservierte, einzelsträngige, nicht-codierende RNA-Moleküle, die spezifisch an mRNA binden und so die Proteinproduktion post-transkriptional inhibieren.

miRNA-Strukturschema

miRNA

Abbildung 1: Allgemeines Schema der stem-loop-Struktur von miRNAs
http://abcommunity.lifetechnologies.com/community/real-time_pcr/blog/2013/03/29/why-so-many-different-mirna-names-3p-vs-5p-what-does-it-mean

Regulation durch miRNAs spielt eine entscheidene Rolle in der Genexpression und sie kontrollieren damit eine Vielzahl an zellulären und metabolischen Funktionen. Ihre spezifischen Zielstrukturen und ihre genaue biologische Funktion sind bis jetzt jedoch meist noch nicht geklärt.

Methoden

Wo haben wir unsere miRNAs her?

Die verwendeten Genome der verschiedenen Spezies und die Sequenzen der miRNAs wurden aus online-Datenbanken heruntergeladen (Fileformat: .fa). Es wurden die miRNA-Sequenzen für alle Spezies außer vier Spezies verwendet. Bei den Spezies handelte es sich um: Diese Sequenzen waren in der miRBase noch nicht annotiert. Bei den Sequenzen der miRNAs handelte es sich um die unprozessierte ("unmatured") stem-loop-Struktur der miRNAs.

Tabelle 1: Genom- & miRNA-Sequenzdatenbanken der betrachteten Spezies
Spezies Abkürzung Genom (Version) miRNA
Plutella xylostella pxy NCBI_AHIO01.1 miRBase
Bombyx mori bmo Other_mbmo2.0 miRBase
Manduca sexta mse NCBI_Msex_1.0 miRBase
Melitaea cinxia mci ENSEMBL_v1.0 noch nicht annotiert
Heliconius melpomene hme Other_Hmel1.1 miRBase
Danaus plexippus dpl ENSEMBL_DanPle_1.0, Other_3.0 noch nicht annotiert
Tribolium castaneum tca Other_Tcas_3.0 miRBase
Dendroctonus ponderosae dpo ENSEMBL_v1.0 noch nicht annotiert
Nasonia vitripennis nvi Other_Nvit_2.0 miRBase
Apis mellifera ame NCBI_Amel_4.5 miRBase
Anopheles gambiae aga ENSEMBL_AgamP4 miRBase
Drosophila melanogaster dme ENSEMBL_BDGP5 miRBase
Rhodnius prolixus rpr ENSEMBL_v1.0 noch nicht annotiert
Acyrthosiphon pisum api Other_assembly2 miRBase
Locusta migratoria lmi NCBI_v1.0 miRBase

miRNA-Alignment

Zuerst wurden die Homologen (Orthologe & Paraloge) miRNA-Sequenzen in den Genomen herausgefiltert. Dazu wurden die gesamten heruntergeladenen miRNA-Sequenzen gegen die einzelnen Speziesgenome geblastet. Damit wurden noch nicht annotierte miRNA-Sequenzen identifiziert. In Abhängigkeit der zugeordneten Spezies wurden die Hits unterschiedlich interpretiert: Alle miRNA-Sequenzen wurden nach Bestimmung der Homologie in ihre jeweiligen übergeordneten Familien zusammengefasst.
Die miRNAs in den Familien wurden gegeneinander geblastet, um ihre Sequenzhomologie zu bewerten.

Diese Scores waren der Ausgangspunkt für das weitere Vorgehen!

Filtern der miRNA-Familien

Die miRNA-Familien wurden bzgl. der Scores der miRNA-Alignments gefiltert. Dabei wurden alle miRNA-Familien ausgewählt in denen ein Sequenzalignment mit einem Score von unter 30 auftrat. Diese Familien wurden dann noch dahingehend selektiert, ob sie von einer Spezies Paraloge-miRNA-Sequenzen enthält oder nicht.

Anwendung der Graphentheorie auf diese Familien!

Die Verwendung der Graphentheorie diente dazu die Sequenz in den miRNA-Familien zu finden, die am wenigstens zu den anderen Sequenzen in der Familie passt!

Graphentheorie

Mit Hilfe der Graphentheorie wurde die Sequenzen in einer miRNA-Familie herausgefiltert, deren Alignments den geringsten Score aufweisen. Dazu wurde aus jeder miRNA-Familie ein Graphen nach folgendem Aufbau erstellt:

Graphentheorie

Abbildung 2: Graphentheorie

Ziel der Graphentheorie: Isolation der Spezies, deren miRNA-Sequenz die geringste Ähnlichkeit mit den anderen miRNA-Sequenzen aufwies. Vorgehen: Die dazu verwendeten Scripte:

Ergebnisse

1. miRNA-Alignment

miRNA Alignment

Abbildung 3: Beispielhaftes Sequenzalignment der verschiedenen miRNAs in einer miRNA-Familie

2. Bestimmung der Spezies in den miRNA-Familien, die die niedrigsten Scores aufwies

miRNA

Abbildung 4: Aufteilung der am wenigstens passenden Sequenzen über die verschiedenen Spezies. In den Familien war pro Spezies max. eine miRNA zu verzeichnen.

miRNA

Abbildung 5: Aufteilung der am wenigstens passenden Sequenzen über die verschiedenen Spezies. In den Familien war pro Spezies min. eine miRNA zu verzeichnen.

Diskussion

Ein Maß für zur Bewertung der Qualität der alignierten Sequenzen!

miRNA-Sequenzen mit einem Score unter 30 in Danaus Plexippus

1.) miRNA-Familien, die pro Spezies max. eine Sequenz enthielten:

Bei den miRNA-Sequenzen, in deren miRNA-Familien jeweils nur eine miRNA pro Spezies gefunden wurde, sind die miRNA-Familien: Die miRNA-Gene der obenstehenden drei miRNA-Familien weisen bei D. plexippus einen Score S unter 30 auf. Sie weichen somit auffällig von den alignierten miRNA-Sequenzen der anderen untersuchten Spezies ab.
Jedoch sind diese drei miRNAs bisher noch nicht dahingehend untersucht, dass ihre Zielstrukturen bzw. Funktionen geklärt werden konnten. Die Veränderungen in den miRNA-Genen von D. plexippus in diesen drei miRNAs weisen somit keine bisher bekannten Funktionsänderungen gegenüber anderen fliegenden Arthropoden auf.

2.) miRNA-Familien, die pro Spezies min. eine Sequenz enthielten:

Bei den folgenden miRNA-Familien sind die jeweiligen Funktionen und Zielstrukturen noch nicht bekannt: Für diese beiden miRNA-Familien konnten bisher noch keine Zielstrukturen bzw. Funktionen nachgewiesen werden. Bei den anderen vier miRNA-Familien sind die sowohl die Zielstrukturen als auch ihre Regulationsmechanismen in Drosophila melanogaster bekannt.

a) MIPF0000013_mir-25.fa.clw.log.gph (Schlechtester Score: dpl3-mir-92b)

(Künstliche) Expression von miRNAs der miR-92 induziert in dme die Expression des Flügelspezifischen Transkriptionsfaktors MS1096-Gal4. Die Expression dieses Faktors führt in dme zu einem Verlust von Flügelhaaren entlang der longitudinal verlaufenden Venen. Des Weiteren sind die betroffen Flügen - verglichen mit expressionsfreien Flügeln - morphologisch veränderten [3].

b) MIPF0000014_mir-9.fa.clw.log.gph (Schlechtester Score: dpl3-mir-9b)

In dme kontrolliert die mir-9 familie die Entwicklung der Flügel. Die mir-9-Familie greift dabei in die Expression eines speziellen Proteins ein. Die Expression des Protein LIM wird reguliert. Die Regulationen finden im Bereich der 3′ untranslated region des Transkriptionsfaktors LIM (Bases in 3' UTR - 1759; within the 3'UTR are several copies of ATTTA thought to result in transient instability) statt. Expremiertes LIM inhibiert direkt die Aktivität des Gens Apterous, das für eine korrekte Flügelbildung verantwortlich ist. Durch die Aktivität von Apterous werden im dorsalen und ventralen Bereich der Flügel unterschiedliche Integrine - transmembrane Oberflächerezeptoren zur Verankerung von Zellen an der extrazellulären Matrix - auf den Zellen präsentiert [4].

c) MIPF0000156_mir-277.fa.clw.log.gph (Schlechtester Score: dpl3-mir-277)

Die Mitglieder der mir-277-Familie kontrollieren den Abbaustoffwechsel bestimmter, kurzkettiger, hydrophober Aminosäuren. Bei diesen Aminosäuren handelt es sich um Valin, Leucin und Isoleucin. Die mir-277-Familie kontrolliert über den Stoffwechsel dieser Aminosäuren nicht nur deren cytoplasmatischen Vorkommen, sondern zudem die Konzentration aller Enzyme, die diese Aminosäuren enthalten. Ein verstärkter Abbau dieser drei Aminosäuren führt direkt zu einer down-Regulation vieler Enzyme [5].

d) MIPF0000588_mir-932.fa.clw.log.gph (Schlechtester Score: dpl3-mir-932)

miRNAs dieser miRNA-Familie haben einen entscheidenden Einfluss auf die Entwicklung eines Organismus. Diese miRNAs agieren als Modulatoren des Hedgehog-Signallings. Überexpression von miR-932 resuliert in einer Verstärkung des Hh-Signalwegs, wobei gleichzeitig dessen Reichweite reduziert wird. Der Hh-Signalweg wird dabei über eine Regulation des Hh-Corezeptors Boi (Brother of ihog). Die Regulation durch miR-932 erfolgt dabei direkt durch Bindung an die 3′UTR von Boi [6].
Veränderungen dieser miRNA in dpl könnten im Zusammenhang mit einer an die Migrationsstrecke angepasste Flügelmorphologie verbunden sein, da:

Literatur

[1] MacFarlane, L.-A., Murphy, P. R.: MicroRNA: Biogenesis, Function and Role in Cancer, Current Genomics, 2010, 11:537-561
[2] He, L., Hannon, G. J.: MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation, Nature Reviews Genetics, 2004, 5:522-531
[3] Schertel, C., Rutishauser, T., Förstemann, K., Basler, K.: "Functional Characterization of Drosophila microRNAs by a Novel in Vivo Library", Genetics, 2012, 192(4):1543-52
[4] Biryukova, I., Asmar, J., Abdesselem, H., Heitzler, P.: "Drosophila mir-9a regulates wing development via fine-tuning expression of the LIM only factor, dLMo", Dev. Biol, 2009, 327(2):487-96
[5] Stark et al.: "Identification of Drosophila MicroRNA targets", PLoS Biol., 2003, 1:E60
[6] Gao, L., Wu, L., Hou, X., Zhang, Q., Zhang, F., Ye, X., Yang, Y., Lin, X.: "Drosophila miR-932 modulates hedgehog signaling by targeting its co-receptor Brother of ihog", Dev. Biol., 2013, 377(1):166-76