Protokoll zum Praktikum WS1112 Gruppe 3
PKR und P23: Grundlagen
Aufgabenstellung
Ergebnisse
Phylogenie und Genstruktur
Proteinsequenz des humanen P23 verwendet
Bestimmung der Genstruktur für P23
Suche nach Orthologen in Genome Browser (UCSC)
Suche nach verfügbaren mRNA-Sequenzen aller Orthologen (NCBI)
Genstruktur von P23 in Homo sapiens
Vorkommen von Paralogen, die keine Introns besitzen
Ausschluss dieser über Genstruktur
Phylogenetische Verbreitung von P23 in Vertebraten
| Spezies | Proteinsequenz | mRNA-Sequenz |
|---|
| Homo sapiens |
ja |
ja |
| Mus musculus |
ja |
ja | /
| Cavia porcellus |
nein |
nein |
| Orycotlagus cuniculus |
nein |
ja |
| Bos taurus |
nein |
ja |
| Oncorhynchus mykissgi |
nein |
ja |
| Taeniopygia guttata |
nein |
ja |
| Ovis aries |
nein |
nein |
| Sus scrofa |
ja |
ja |
| Monodelphis domestica |
predicted |
ja |
| Gallus gallus |
ja |
ja |
| Xenopus laevis |
ja |
ja |
| Danio rerio |
ja |
ja |
| | |
P23 in Vertebraten hochkonserviert
am weitesten vom Menschen entfernte Sequenzen konnten bei den Echten Knochenfischen (Teleostei) gefunden werden
in Pilzen und Pflanzen aehnliche Proteine mit starken Abweichungen in Sequenz und Genstruktur gefunden und daher ausgeschlossen
Definieren einer vermuteten Aktivatorsequenz
Suche nach weiteren Vertretern des Proteins in Metazoen
durch Abgleich von allen gefundenen Proteinsequenzen mit Genomdatenbank vom Server (blastScript.pl)
➪ Lokalisierung der Exons im Genom (als Blastoutput)
Auswahl und Sortieren signifikanter Hits (tblastn_pipe.pl, verwendete Parameter: a1 = 32, a2 = 98, b1 = 130, b2 = 172, eval = 10e-10)
➪ Koordinaten des ersten und des letzten Exons in Genomen verschiedener Spezies
Ausschneiden der vermuteten Aktivatorsequenz in der 5'UTR (get_fastcmd.pl, fprime = 2000 nt, tprime = 200 nt)
➪ genomische Sequenz, die das erste Exon, die Aktivatorsequenz und Introns enthalten sollte
Alignment mit ClustalW
Vollstaendiges Alignment
grosse Uebereinstimmung innerhalb der Euteria
➪ diese Sequenzen ausgewaehlt für weitere Untersuchung
ausgewaehlte genomische Sequenzen mit gefundenen mRNAs alignt (manuell)
blastall
Mehr Arten gefunden
all.bl
Vermutete Aktivator am 5'UTR ausscheiden
Problem: Aktivatorsequenz unbekannt
2000 nt vor Exon1 ausschneiden
mit fastcmd
output: all.mot
Alignment auf all.mot mit clustalW
output: all_aktivator.stk
Alignment auf mammals
output: mammals.stk
mRNA Alignment MANUELL (all mRNA vs mammals.stk)
Folden
1. all_aktivator.stk
2. all_mammals.stk
3. cutblock.stk
4. finalcut.stk
RNAz
R-Coffee
RNAfold
Emacs