Protokoll zum Praktikum WS1112 Gruppe 3

Einleitung

Die Protein Kinase R (PKR) ist ein in Eukaryoten weit verbreiteter intrazellulären Sensor für Stress. Zum einen spielt die Kinase eine wichtige Rolle bei Differenzierung und Zellwachstum, indem sie die Genexpression reguliert. Dies kann sowohl auf Transkriptionsebene über NFκ-B als auch auf dem Level des RNA-Splicens erfolgen. Dabei wird PKR von Sekundärstrukturen in den untranslatierten Regionen (UTRs) von mRNAs aktiviert und verändert die Effektivität der Splicing-Reaktion. Zum anderen ist PKR ein wichtiger Bestandteil bei der Abwehr viraler Infektionen. Aktiviert durch dsRNA, inhibiert sie durch Phosphorylierung des eukaryotischen Initiationsfaktors 2α (eIF2α) die Translation und führt somit zur Apoptose.

Das translationally controlled tumor protein (TCTP/P23) ist, anders als sein Name vermuten lässt, nicht spezifisch für Tumore. Es weist vielmehr eine hohe Sequenzkonservierung zwischen allen Eukaryoten auf und wird ubiquitär exprimiert. Es wird daher vermutet, dass es sich um ein sehr wichtiges zelluläres Protein handelt, dessen genaue Funktion jedoch noch nicht hinreichend geklärt ist. In der Literatur wurden bereits Tubulin- und Calcium-Bindungseigenschaften beschrieben, die Einfluss auf Wachstum und Proliferation haben. Zudem aktiviert es verschiedene Bestandteile des Immunsystems (u.a. Macrophagen, B-Zellen), ist Teil der zellulären Antwort auf Stress und kann Apoptose induzieren.

Zielstellung

Es ist bekannt, dass PKR von der hoch strukturierten mRNA von TCTP/P23 aktiviert werden kann. Die Aktivatorsequenz konnte auf die UTRs eingegrenzt, jedoch noch nicht exakt lokalisiert werden. Ebenso wenig ist die genaue Struktur des Aktivators bekannt. Ziel dieses Praktikums war es daher, mit Hilfe von phylogenetischen Daten eine potentielle Aktivatorsequenz zu identifizieren und nach Möglichkeit konservierte Strukturelemente zu bestimmen.

Ergebnisse

Phylogenie und Genstruktur

  • Proteinsequenz des humanen P23 verwendet
  • Bestimmung der Genstruktur für P23 in verschiedenen Spezies
  • Suche nach Orthologen in Genome Browser (UCSC)
  • Suche nach verfügbaren mRNA-Sequenzen aller Orthologen (NCBI)

    • Genstruktur von P23 in Homo sapiens

    Genstruktur

  • Genstruktur ist hochkonserviert
  • jedoch auch Paraloge, die keine Introns besitzen, gefunden
  • diese konnten über die Genstruktur ausgeschlossen werden

    • Phylogenetische Verbreitung von P23 in Vertebraten

    /
    Spezies Proteinsequenz mRNA-Sequenz
    Homo sapiens ja ja
    Mus musculus ja ja
    Cavia porcellus nein nein
    Orycotlagus cuniculus nein ja
    Bos taurus nein ja
    Oncorhynchus mykissgi nein ja
    Taeniopygia guttata nein ja
    Ovis aries nein nein
    Sus scrofa ja ja
    Monodelphis domestica predicted ja
    Gallus gallus ja ja
    Xenopus laevis ja ja
    Danio rerio ja ja

    Phylogenetische Verbreitung von P23
  • P23 ist in Vertebraten hochkonserviert
  • am weitesten vom Menschen entfernte Sequenzen konnten bei den Echten Knochenfischen (Teleostei) gefunden werden
  • in Pilzen und Pflanzen aehnliche Proteine mit starken Abweichungen in Sequenz und Genstruktur gefunden und daher ausgeschlossen

    • Definieren einer vermuteten Aktivatorsequenz

    Suche nach weiteren Vertretern des Proteins in Metazoen

  • Abgleich von allen gefundenen Proteinsequenzen mit Genomdatenbank vom Server (blastScript.pl)
    ➪ Lokalisierung der Exons im Genom (als Blastoutput)
  • Auswahl und Sortieren signifikanter Hits (tblastn_pipe.pl, verwendete Parameter: a1 = 32, a2 = 98, b1 = 130, b2 = 172, eval = 10e-10)
    ➪ Koordinaten des ersten und des letzten Exons in Genomen verschiedener Spezies
  • Ausschneiden der vermuteten Aktivatorsequenz in der 5'UTR (get_fastcmd.pl, fprime = 2000 nt, tprime = 200 nt)
    ➪ genomische Sequenz, die das erste Exon, die Aktivatorsequenz und Introns enthalten sollte
  • Alignment mit ClustalW

    • Alignment 1

    Vollständiges Alignment
  • große Übereinstimmung innerhalb der Euteria
    ➪ diese Sequenzen ausgewählt für weitere Untersuchung
  • ausgewählte genomische Sequenzen mit gefundenen mRNAs alignt (manuell)
  • Blöcke mit Übereinstimmmung zwischen mRNA und genomischer Sequenz grosszügig ausgeschnitten

    • Vorhersagen möglicher Sekundärstrukturen

  • Suche nach konservierten Strukturelementen in der ausgeschnittenen genomischen Sequenz
    ➪ mit RNAz
    ➪ mit R-Coffee
  • Suche nach Strukturen in der 5'UTR der mRNA-Sequenzen (RNAfold und RNAalifold):

    Konsensus Homo sapiens Mus musculus

    Konsensustruktur aller mRNAs RNAalifold

    Struktur 5UTR Mensch RNAfold

    Struktur 5UTR Maus RNAfold
    ΔG = -32,57 kcal/mol ΔG = -189,60 kcal/mol ΔG = -182,19 kcal/mol
    Gallus gallus Xenopus laevis Danio rerio

    Struktur 5UTR Huhn RNAfold

    Struktur 5UTR Frosch RNAfold

    Struktur 5UTR Fisch RNAfold
    ΔG = -138,66 kcal/mol ΔG = -108,60 kcal/mol ΔG = -122,03 kcal/mol