Interferon-Gamma IFNg

Methoden

Phylogenetische Konservierung und Lokalisation von IFNg im Genom

  • verwendete Datenbanken

    • Blasten der Proteinsequenzen gegen Genome

  • Heraussuchen der Proteinsequenzen ueber NCBI (Ordner Konservierte_Protein_Sequenzen)
  • Blasten der Proteinsequenz gegen Genome aus verschiedenen Datenbanken (ENSEMBL,UCSC,NCBI,...) mit Hilfe des Skripts blastSkript.pl
  • Befehle generieren in blast.befehle mit blastSkript.pl, Ausgangsproteinsequenzen in Ordner Konservierte_Protein_Sequenzen
  • generierte Befehle in blast.befehle ausfueren -Folder.bl entstehen mit zugehoerigen Hits
  • Auswahl der gefunden Sequnezen mit verschiedenen Parameter duch tblastn_pipe.pl, Ausgangsfolder mit .bl,gespeichert in hits2, Parameter: #segment 1 my $a1= 1; my $a2= 38; my $evala= 1.0e-5; #segment 2 my $b1= 123; my $b2= 167; my $evalb= 1.0e-5;
  • Ausschneiden der Sequenzen mit get_fastcmd aus hits2, Befehle in blast_befehle_new
  • Einstellungen get_fastcmd: f prime:126 nt, t prime: 78 nt
  • Ausfueren von blast_befehle_new - ausgeschnittene Sequenzen sind im Ordner fasta-motif
  • ausgeschnittene Sequenzen sind unter 5UTR.fa zusammengefasst
  • mit clusalw Aligment von ausgeschnittenen Sequenzen (5UTR.fa), Umwandlung in IFNg.aln,IFNg.dnd

    • Auswahl der PKR-bindenden Domaene und multiples Alignment

  • Ausschneiden der Sequenzen mit get_fastcmd --> 78nt von der coding region des 1.Exons + 126 nt der 5'UTR
  • Multiples Alignment mit ClustalW (25 Sequenzen, Homo sapiens - Dasypus novemcinctus), Umwandlung in Stockholm-Format

    • RNA-Strukturalignments

    Emacs (Stockholmformat) Strukturvorhersage des kompletten Aligments + partielle Aligments
    RMdetect Vorhersage von K-turns
    RNAalifold Faltung von Konsensussequenzen; Berechnung der minimalen, freien Energie
    locARNA visuelle Faltung von RNAs mit Strukturbeschraenkungen
    gfold Berechnung der minimalen, freien Energie einer gegebenen RNA-Sekundaerstruktur

    Ergebnisse

    Phylogenische Konservierung

  • Protein bis zu Dasypus novemcinctus erhalten Ensembl_Blast_Mensch_gegen_Dasypus mRNA_IFNg_Dasypus
  • in Macropus eugenii nicht mehr konserviert Ensembl_Blast_Mensch_gegen_Macropus
    •

    Genomische Struktur

  • mRNA-Sequenz_Homo_Sapiens
  • Chr12:68548555-68553486
  • Bindungsstelle fuer PKR am 5'Ende (5'UTR+Anfang der coding region; Cohen-Chalamish et al.,2009)

    • Multiples Alignment

  • Multiples Alignment IFNg

    • Sekundaerstruktur

    Sekundaerstruktur mit emacs

  • keine Vorhersage des Pseudoknotens
  • bei Faltung des gesamten Alignments kaum Strukturelemente gefunden, keine Uebereinstimmung mit durch Paper postulierte Struktur
  • bei Homo_Sapiens bis Bereich um Pseudoknoten und kink-turn relativ gute Vorhersage Sekundaerstruktur_Homo_Sapiens
    •

    Sekundaerstruktur mit RNAfold

    mit constraint (-53.91 kcal/mol) ohne constraint (-60.46 kcal/mol)

    kink-turn (RMdetect)

  • Position innerhalb der Primaten entspricht Lokalisation des Kink-turns im menschlichen INFg (Cohen-Chalamish,2009)
  • Equus caballus und Loxodonta africans --> K-turn an anderer Position
  • Myotis luciferans --> Punktmutation im hinteren K-turn-Motiv T-->G -->Destabilisierung des Stamms (K-turn eher unwahrscheinlich)
  • Sus scrofa --> Kink-turn laut Cohen-Chalamish an homologer Position wie Primaten, von RMdetect allerdings nicht erkannt
  • mRNAs mit K-turns laut RMdetect
  • theoretische K-turn-Motive

    • Pseudoknoten (pKnots)

  • keine dem Paper entsprechende Vorhersage fuer Homo sapiens

  • -56.30 kcal/mol
    •

    RNA-Strukturaligment

    RNAalifold

  • Konsensusstruktur Primaten
  • vorhergesagte RNA-Struktur von Primaten im Vergleich zum Menschen nicht aehnlich, obwohl sehr aehnliche Sequenz
    • ohne constraint (-90.47 kcal/mol) mit constraint (-74.02 kcal/mol)
     
  • Struktur Homo sapiens
  • vorhergesagte Struktur fuer Primaten-Konsensussequenz geringere freie Energie als postitulierte "Paper-Sequenz" fuer Homo sapiens
    •

    Auswirkungen von Mutationen in HS IFNg-mRNA auf Sekundaerstruktur

  • s2a und s2ab --> keine Bindung von PKR
  • s2b --> Bindung aufgrund alternativer Faltung des 3'-S2-Helixstammes mit den 7 terminalen Nukleotiden des 5'Endes (Cohen-Chalamish,2009)
  • Vorhersage der Sekundaerstruktur mit RNAfold
  • mRNA-Sequenzen mit Mutationen
    •          
  • S3-Stamm in allen Mutanten konserviert
    •  
    s2as2bs2abs2iPL
    -56.68 kcal/mol-64.41 kcal/mol-62.23 kcal/mol -55.96 kcal/mol -55.02 kcal/mol
    s2b alternative Struktur mit constraint
    -59.85 kcal/mol