Gammaretoviren gehören wie die Alpha-, Beta- und Deltaretroviren, Lenti- und Spumaviren zu den Retroviren.
Retroviren haben einen Durchmesser von 100nm. Sie besitzen eine Hülle, in der sogenannte spikes enthalten sind.
Das sind zum einen das äußere Hüllen - Glykoprotein SU und zum anderen das transmembrane
Glykoprotein TM . Beide sind über Disulfidbrücken miteinander verbunden. SU ist das eigentliche
Antigen, welches sich an die Zelle nach dem Schlüssel - Schloß - Prinzip bindet. TM ist dafür
verantwortlich, dass das SU in der Hülle bleibt. Weiterhin initiiert es die Membranfusion von Virus und
Wirtszelle.
Das Genom der Gammaretroviren hat folgenden Aufbau:
Die Sequenzen der Gammeretroviren nahmen wir von der Datenbank des NCBI (National Center for Biotechnology Information).
Um eine Liste aller Sequenzen zu erhalten, muss folgende Anfrage an die Datenbank erfolgen:
Im Auswahlmenü SEARCH wird das Element "Nucleotid" gewählt.
Anschließend gibt man in die Eingabezeile FOR folgendes ein:
"gammaretrovirus complete 5000:15000[slen]"
Das Ergebnis der Anfrage an die Datenbank sind 31 Sequenzen, von denen wir 14 Sequenzen wählten.
Die oben genannten Sequenzen wurden einzeln im FASTA Format gespeichert und bearbeitet. Aus dem Header jeder
einzelnen Datei wurde der Anfang und alle Pipes ("|") entfernt.Anschließend wurden die Dateien, mittels
"cat *.fa > sequenz.seq" zu einer einzigen Datei
zusammengefügt.
Diese Datei dient als Input für clustalw, dialign oder code2aln.
Für den ersten Durchlauf nutzen wir das Programm ClustalW. Dabei fiel auf, dass die
Sequenzen
M23385 und
NC_001514
einen score von 100 haben. Daraus lässt sich schlußfolgern, dass diese beiden Sequenzen identisch sind.
M23385 wurde
daraufhin aus der Sequenzdatei entfernt.
NC_001514 und
Z93724 wurden
ebenfalls entfernt, da diese beide Sequenzen beim paarweisen Alignment mit den anderen Sequenzen einen sehr niedrigen score
hatten. J01998 wird
ebenfalls nicht berücksichtigt. Denn diese Sequenz hat einen score von 98 mit
NC_001885
Um diese 4 Sequenzen zu entfernen, benötigten wir 3 Durchläufe von ClustalW. Somit
blieben noch 10 Sequenzen übrig, die nochmal mittels ClustalW und Code2aln analysiert wurde. Hier können die Ergebnisse betrachtet
werden.
Die Ausgabedatei von clustalw wurde mittels dem Pearlscript aln2nex.pl in eine Datei im
Nexus-Format umgewandelt: ausgabe.nxs. Anhand dieser Datei konnte mittels
Splitstree ein phylogenetischer Baum erstellt werden. Eine weiterer phylogenetischer Baum wurde mittels der
Ausgabedatei von code2aln erstellt.
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Abb. 2: Phylogenetischer Baum; Clustalw |
Abb. 3: Phylogenetischer Baum; Code2aln |
In beiden Bämen lassen sich zwei größere Gruppen erkennen.
Im Vergleich der beiden Bäume zeigen sich nur wenige Unterschiede in
Bezug auf die Anordnung der einzelnen Sequenzen.
Das heißt, dass die Struktur der beiden Bäume ähnlich ist. Allerdings sind einzelne Sequenzen in dem jeweiligen Baum verschieden
angeordnet. Es wurden somit verschiedene verwandschaftliche Beziehungen zwischen den Sequenzen festgestellt. Dies ist wohl auf
ein unterschiedliches Alignment zurückzuführen.
Die Datei sequenz.seq wird mit dem tool readseq, ist im Vienna RNA Package enthalten, vom FASTA
in das Vienna Format umgewandelt.
Codezeile: readseq -a -v -f=19 sequenz.seq > sequenz.rna
In dieser Datei sind alle Sequenzen. Es wurde aber die Datei gesplittet, damit die Sequenzen einzeln berchnet werden konnten.
Anschließend wird RNAfold für jede einzelne Sequenz ausgeführt.
Beispiel: RNAfold -p < Inputdatei > output.out
Mittels RNAfold werden die einzelnen Sequenzen gefaltet und die wahrscheinlichste (minimum free energey) Sekundärstruktur und die
Basenpaarungswahrscheinlichkeit errechnet. Ergebnis dieser Berechnung ist eine postscript Datei und eine *.mfe Datei.
In der postscript Datei ist der Dotplot dargestellt. Mittels Alidot wird eine bessere Betrachtung
ermöglicht.
Wenn zwei Basen i, j aus der Sequenz miteinander paaren, dann wird das an entsprechender Stelle (i, j) im Dotplot markiert. Ist die Farbe
des Punktes rot, bedeutet dies, dass dieses Basenpaar in allen Sequenzen gleich ist. Die Sequenz ist damit konserviert.
Über die Farben ocker, grün nach blau nimmt die Zahl der verschiedenen Basenpaarungen zu. Wenn der Punkt blau ist,
dann ist die Sekundärstruktur konserviert. Es handelt sich um konsistente Mutationen.
Je größer der Punkt, um so größer ist die Wahrscheinlichkeit mit der diese Basenpaarung vorrausgesagt wurde.
Die mfe Datei enthält die Sekundästruktur in der bracket-Notation. Mit Hilfe des Pearlscripts cmount.pl kann man ein
Mountainplot erstellen.
Wir erkannten, dass die Sequenz
AF010170 mit der Länge von 11328 Basenpaaren sich nicht gut ins Gesamtbild einfügt, da alle anderen Sequenzen im Schnitt
nur rund 8000 Basenpaare haben. Deshalb schlossen wir diese Sequenz in unseren weiteren Betrachtungen aus und fertigten einen neuen
Mountainplot an.
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Abb. 4: Mountainplot mit Sequenz AF010170 |
Abb. 5: Mountainplot ohne Sequenz AF010170 |
Anhand des Mountainplots und der Liste von Alidot (ohneAF010170original.out;
ohneAF010170.out;
ohneAF010170geordnet.out) kann nach konservierten Sekundärstrukturen gesucht
werden. Damit der Überblick besser ist, haben wir diese Liste geordnet.
Da wir nur zwei Basenpaarungen mit je 77.8%(d.h.bei etwa 8 von 10 Sequenzen wurde diese Basenpaarung vorrausgesagt) hatten, nahmen wir
auch Basenpaarungen mit 33.3% in unsere Liste mit auf.
Weil wir in der Datenbankanfrage nicht "complete genome" angegeben haben, hatte dies zur Folge, dass wir auch Sequenzen genommen haben,
die nur komplette Sequenzen waren. Auf der Suche nach konservierten Sekundärstrukturen war in der Liste von Alidot besonders auf
Basenpaarungen mit hohen Prozentzahlen zu achten. Die Prozentzahlen geben die Wahrscheinlichkeit an, mit der die Basen eine Paarung
eingehen. Des weiteren muss darauf geachtet werden, dass möglichst viele verschiedene Basen sich in den unterschiedlichen Sequenzen
an dieser Stelle paaren, da dies heißt das nur Mutationen zugelassen wurden, die die Struktur nicht verändert haben.
Da sich in unserer Liste keine hohen Prozentzahlen fanden, haben wir mehrere Bereiche näher betrachtet.
Konservierte Strukturen könnten sich dabei in den Bereichen
595 - 686, 3425 - 3463 und 5915 - 5950 befinden. Für diese Bereiche
erstellten wir mit clustalw nochmal das Alignment und führten RNAalifold aus.
Leider stellte sich heraus, dass wir keine überzeugenden Anhäufungen von Sekundärstrukturen fanden.
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Abb. 6: Sekundärstruktur mit AF010170 |
Abb. 7: Sekundärstruktur ohne Sequenz AF010170 |
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In diesem Bereich existieren ein paar consistent mutations und nur 2 compensatory mutations.
Wir vermuten, dass es sich hierbei
um eine Sekundärstruktur handelt, die auf Sequenzebene konserviert ist. Dies folgern wir aus der grossen Anzahl an schwarzgefärbten
Basen bei der Sekundärstruktur. Des weiteren zeigt der Ausschnitt, der mittels ClustalX erstellt wurde, dass viel Basen in vielen Sequenzen
einheitlich vorkommen.
Es handelt sich hierbei wahrscheinlich um einen Teil des proteinkodierenden Bereiches pol.
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Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um eine Sekundärstruktur, die auf Sequenzebene konserviert ist. Deutlich zu erkennen ist, wie schon
vorherigem, die schwarze Färbung der Basen. Nur 4 Basen besitzen eine gräuliche Färbung. Durch die Ausgabe von ClustalX kann man
besonders gut erkennen, dass die ersten 5 Sequenzen fast im ganzen Bereich übereinstimmen. Jene 5 Sequenzen sind auch laut phylogenetischen Baum
eng miteinander verwandt.
Auch hier handelt es sich wahrscheinlich um einen Teil des pol- Bereiches.
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In diesem Abschnitt sind relativ viele Basen schwarz umkreist. Die meisten von ihnen gehen eine Basenpaarung mit einer weiteren schwarz umkreisten Base ein. Man spricht hier von einer compensatory mutation. Allerdings ist ein Grossteil der Basen nur grau gefärbt. Dies lässt darauf schliessen, dass die Basen an diesen Stellen sehr stark variieren. Von daher vermuten wir, dass es sich hierbei nicht um eine konservierte Sekundärstruktur handelt. Die Anzahl der konservierten Basenpaare ist, unserer Meinung nach, nicht hoch genug, um damit auf eine konservierte Sekundärstruktur zu schliessen.
postscript Datei: